Leptospira

				BECOME A MEMBER สมัคร ! สมาชิกชมรมรักสุขภาพ ฟรี ข่าวสาระความรู้เรื่องสุขภาพ

การตรวจวินิจฉัยหาเชื้อเลปโตสไปโรซิส ทางห้องปฏิบัติการ

Browser คุณไม่ support Java / your browser does not support JAVA
จึงไม่สามารถแสดงผลได้

มีหลักการตรวจด้วยกัน 2 ลักษณะคือ
1. การตรวจหาเชื้อโดยตรงจากสิ่งส่งตรวจ เช่น เลือด ปัสสาวะ น้ำไขสันหลัง
   - โดยการใช้กล่อง dark field microscope / ย้อมด้วย giemsa stain
   - การเพาะเลี้ยงเชื้อจากสิ่งส่งตรวจ ในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบพิเศษคือ EMJH เป็นวิธีที่มีความสำคัญ
     เพราะสามารถแสดงตัวเชื้อที่เป็นต้นเหตุได้เลย แต่ค่อนข้างต้องใช้เวลา แต่ควรทำควบคู่ไป
      กับการทดสอบอื่นด้วย
   - การฉีดเข้าสัตว์โดยตรง โดยใช้ตัวอย่างคนไข้ฉีดเข้าในหนูตะเภา หรือ แฮมสเตอร์ สัตว์จะป่วย
     ดูดน้ำในช่องท้องไปตรวจหาเชื้อต่อไป
   - การตรวจหา ดีเอ็นเอของเชื้อโดยใช้เทคนิค PCR มีความไวสูง แต่ต้องอาศัยเทคนิค ผู้ชำนาญ
     ค่าใช้จ่ายสูง

2 การตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อเลปโตสไปโรซีส
     โดยปกติจะเริ่มมีแอนติบอดีย์หลังเริ่มมีอาการไปแล้วประมาณ 1 อาทิตย์ และจะมีระดับสูงสุด
     ประมาณ 4 อาทิตย์ การตรวจควรตรวจแบบ pair serum โดยเจาะห่างกัน 1 อาทิตย์

ชนิดในการทดสอบมีด้วยกันหลายวิธี เช่น
Microscopic Agglutination test ( MAT)
Indirect Heagglutination Test (HA) /
Macroscopic Slide Agglutination Test (MSAT)
Indirect Fluoresent Antibody Technique (IFA)
Latex Agglutination Test (LA)

การตรวจโดยวิธีมาตรฐาน ก็คือการเพาะแยกเชื้อจากตัวสิ่งส่งตรวจ แต่เนื่องจากการเพาะเลี่ยงเชื้อ
ยุ่งยากและใช้เวลา จึงได้ถือเอาวิธี Microscope Agglutination test (MAT) เป็นวิธีมาตรฐานแทน
ซึ่งสามารถตรวจแยกชนิดสายพันธุ์ได้

ตัวอย่างที่ใช้ในการตรวจ
- เลือดและน้ำไขสันหลัง ควรเก็บตัวอย่างภายใน 1 สัปดาห์หลังเริ่มแสดงอาการ ควรมีการเจาะเลือด
2 ครั้งห่างกัน 1 อาทิตย์ ปั่นเอาน้ำเหลืองมาทำ

การทดสอบ
- ปัสสาวะ ควรเก็บตัวอย่างหลังแสดงอาการเพื่อนำไปเพาะเลี้ยงเชือ้
- ควรเก็บตัวอย่างก่อนคนไข้ได้รับยาปฏืชีวนะ

การตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อเลปโตสไปโรซีส
โดยวิธี Microscopic Agglutination Test (MAT)

ถือเป็นวิธีมาตรฐานสำหรับการตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซีส

หลักการ
ใช้เชื้อ Leptospira ทั้ง 26 Serovars เป็นแอนติเจนเพื่อทำปฏิกริยากับแอนติบอดีย์ต่อ
เลปโตสไปโรซีส ในซีรั่มผู้ป่วย ที่ต้องการทดสอบ จะเกิดปฏิกริยาการจับกลุ่ม (Agglutination) เมื่อดู
ด้วยกล้อง dark field ผลบวกจะเกิดการเกาะกลุ่มกันของเชื้อ Leptospira การตรวจทุกครั้งควรทำ
Positive/Negative control ควบไปด้วยทุกครั้ง

วิธีการตรวจ
1. เจือจางซีรั่มให้เป็น 1 : 50 ด้วย PBS
2. ใช้ pipette ดูดซีรั่มที่เจือจางแล้ว จำนวน 50 ไมโครลิตร มาหยดลงในหลุมจำนวน 26 หลุม
3. นำแอนติเจนจำนวน 26 ซีโรวาร์ที่ได้เตรียมไว้ มาหยดลงในแต่ละหลุม
4. เขย่าให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 2 ชั่วโมง
5. อ่านผลการตกตะกอนด้วยกล้อง Dark field

การอ่านผลการตรวจ

4+	100% Clearance of Leptospirosis from the field
3+	75% Clearance of Leptospirosis from the field
2+	50% Clearance of Leptospirosis from the field
1+	25% Clearance of Leptospirosis from the field

ผลไตเตอร์ จะตัดสินที่หลุมสุดท้ายที่ให้ผล 50 % agglutination

การแปลผล
จะเห็นการเกาะกลุ่มกันของเชื้อเป้นก้อนหรือจุด รายที่ให้ผล Positive ให้นำไปหาไตเตอร์ต่อ
เชื้อซีโรวาร์นั้นๆต่อ โดยวิธี droplet method
- ซีรั่ม ที่ให้ค่าไตเตอร์ > 1 : 100 ขึ้นไปให้ถือเป็นผลบวก
- ซีรั่มที่ให้ค่าไตเตอร์เท่ากับ 50 ให้พิจารณาเป็นผลบวกเมื่อมีการเพิ่มของไตเตอร์เป็น 4 เท่าในซีรั่มที่สอง

การตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อเลปโตสไปโรซีสโดยวิธี
Indirect Hemagglutination Test (IHA)

หลักการ

นำเชื้อ Leptospira มาเคลือบบนเม็ดเลือดแดงของคน กรุ๊ป โอ แล้วนำมาทำปฏิกริยากับแอนติบอดีย์
ในซีรั่มที่ต้องการทดสอบ เพื่อดูปฏิกริยาการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง

วิธีการตรวจ
1.เตรียม ไมโครไตเตอร์ เพลท ชนิด ก้นตัวยู ( U shape )
2. เจือจางซีรั่มของตัวอย่างที่จะทดสอบ 1 : 50
3. หยดซีรั่มที่เจือจางแล้วจำนวน 50 ไมโครลิตร ลงในหลุม Control และ Test (หลุมทดสอบ)
4. หยด 25 ไมโครลิตร ของ Control Cell ลงในหลุม Control
5. หยด 25 ไมโครลิตร ของ Test cell ลงในหลุมทดสอบ
6. เขย่าให้เข้ากันดี ตั้ใทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 1-2 ชั่วโมง
7. อ่านปฏิกริยาการจับกลุ่มของเม็ดเลือดแดง

การแปลผล
- ที่ Control well จะให้ผลลบ คือไม่มีการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง
- ที่ Test well
< 1 : 50 ผลถือเป็น ผลลบ Negative
1 : 50 ผลถือเป็น Borderline positive
> 1 :100 ผลถือเป็น ผลบวก Positive for Leptospiral antibody
ในกรณีที่ให้ผลลบวก ควรเจือจางซีรั่มเพื่อหาระดับไตเตอร์สูงสุดไว้ด้วย

การตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อเลปโตสไปโรซีสโดยวิธี
Macroscopic Slide agglutination Test (MSAT)

การตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อเลปโตสไปโรซีสโดยวิธี
Latex Slide agglutination Test (LA)

หลักการ
ใช้แอนติเจนความเข้มข้นสูงที่ทำให้เชื้อตายด้วยความร้อนหรือ ฟอร์มาลีน มาผสมกับซีรั่มที่ต้องการ
ทดสอบบนแผ่นกระจก (Slide) ในปริมาณที่เท่าๆกันเอียงแผ่นกระจกไปมาเพื่อให้ผสมเข้ากัน
ตัวอย่างที่ให้ผลบวกจะเกิดการเกาะกลุ่มกันของแอนติเจนบนแผ่นกระจก สามารถมองเห็นด้วย
ตาเปล่าเป็นวิธีการที่สดวกแต่มีความไวน้อยกว่า วิธี MAT มีโอกาสเกิดผลบวกปลอมได้

วิธีการตรวจ

	- หยดซีรั่ม 1 หยด ลงบนแผ่นสไลด์ จำนวน 1 หยด - Add 1 drop of test serum
	- หยดลาเท็กซ์แอนติเจนของเชื้อที่เตรียมไว้แล้ว จำนวน 1 หยด - Add 1 drop of Latex Antigen ( mixed well before use)
	- ผสมให้เข้ากัน - Use toothpaste to mixed together
	- เอียงแผ่นสไลด์ไปมาประมาณ 2-5 นาที นำไปอ่านผลการเกาะกลุ่ม - ควรมีการทำ Positive /Negative Control ควบไปด้วยทุกครั้ง - Rotate about 100 rpm. for 2-5 minute - Should do the Positive/Negative Control at the same time

การแปลผล

ให้ระดับเป็น 4+	เมื่อมีการเกาะกลุ่มกันอย่าง 100 %
ให้ระดับเป็น 3+	เมื่อมีการเกาะกลุ่มกันอย่าง 75 %
ให้ระดับเป็น 2+	เมื่อมีการเกาะกลุ่มกันอย่าง 50 %
ให้ระดับเป็น 1+	เมื่อมีการเกาะกลุ่มกันอย่าง 25 %

ถ้าไม่มีการเกาะกลุ่มใดๆเลย ถือเป็นผลลบ Negative for Leptospilosis

ขนาดการทดสอบและราคา Packing and Price
ขนาด 25 การทดสอบ / กล่อง Size 25 test / box	1,450.00 บาท 33.50 USD
ขนาด 50 การทดสอบ / กล่อง Size 50 test / box	2,600.00 บาท 60.00 USD

For English Version Click Here

การตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อเลปโตสไปโรซีสโดยวิธี ELISA Test

หลักการ

แอนติเจนของเชื้อ Leptospira จะถูกเคลือบติดที่ก้นหลุมของ ไมโครเพลท เมื่อเติมซีรั่มที่เจือจางแล้ว
มาทำการทดสอบลงในหลุมตั้งทิ้งไว้ให้มีการจับตัวกันระหว่าง แอนติเจน-แอนติบอดียืที่มีในซีรั่ม ล้างส่วน
เกินทิ้ง แล้วเติม proxidase conjugate anti-human IgG หรือ IgM ลงไป ล้างเอาส่วนเกินออก
เติม Substrate ลงไป สังเกตุการเปลี่ยนแปลงของสีที่เกิดขึ้นด้วย Microplate reader

วิธีการทดสอบ
- นำไมโครเพลทที่จะใช้ในการทดสอบมาเตรียมรอไว้ ส่วนน้ำยาควรรอให้มีอุณหภูมิเท่ากับอุณหภูมิ
ของห้องเสียก่อน
- เจือจางซีรั่มที่ต้องการทดสอบ ประมาณ 1 : 100
- หยดซีรั่มที่เจือจางแล้วประมาณ 100 ไมโครลิตรลงในหลุมทดสอบ ควรทำ Positive และ Negative
Control ควบคู่ไปด้วย
- Incubate ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นานประมาณ 1 ชั่วโมง
- ล้างเพลทด้วย บับเฟอร์ ประมาณ 4-5 ครั้ง ซับให้แห้ง
- เติม Enzyme conjugate ลงไปหลุมละ 100 ไมโครลิตร
- Incubate ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นานประมาณ 1 ชั่วโมง
- ล้างเพลทด้วย บับเฟอร์ ประมาณ 4-5 ครั้ง ซับให้แห้ง
- เติม Substrate ลงไปทุกหลุมๆละ 100 ไมโครลิตร
- Incubate ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นานประมาณ 15 - 30 นาที
- เติมน้ำหยุดการเกิดปฏิกริยา Stopping Reagent ทุกหลุมๆละ 50 ไมโครลิตร
- วัดค่าความเข้มของสีที่เกิดขึ้นในแต่ละหลุม ด้วย เครื่อง Microplate reader

การรายงานผล
ผลบวก Positive มีค่าความเข้มของสีมากกว่าค่าที่กำหนดให้
ผลลบ Negative มีค่าความเข้มของสีน้อยกว่าค่า cut off value

การตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อเลปโตสไปโรซีสโดยวิธี
Color Immuno Chromatographic Assay Test (CICA)

แอนติเจนของเชื้อ Leptospira จะถูกเคลือบบนแผ่นเซลลูโลส ร่วมกับ Anti-human IgM dye
conjugate ซึ่งจะเกิดการทำปฏิกริยาในขณะการเคลื่อนที่ไปด้วยแบบโครมาโตกราฟฟี่ เกิดเป็น
แถบสีขึ้นมาให้เห็นถ้าตัวอย่างทดสอบมีแอนติบอดียืต่อเชื้อ Leptospira

การทำการทดสอบ
- ใส่น้ำยา Detection reagent จำนวน 250 ไมโครลิตร ลงในหลอดทดสอบ
- หยดซีรั่มที่ต้องการทำการทดสอบลงไป 5 ไมโครลิตร
- นำแถบตรวจมาจุ่มลงในหลอดทดสอบ โดยให้ด้านหัวลูกศรจุ่มลงในหลอดทดสอบ นาน 15-30 นาที
- รอสังเกตุแถบสีที่เกิดขึ้น

การแปลผล
จะเกิดแถบสี ม่วง-ชมพูในส่วนของ lower band เท่ากับ ผลบวก Positive
ไม่เกิดแถบสี ม่วง-ขมพูในส่วนของ lower band เท่ากับ ผลลบ Negative
ถ้าแถบ Control ในส่วนของ upper band ไม่เกิดสี ควรทำการทดสอบใหม่แสดงว่าอาจมีการ
ทำการทดสอบผิดพลาด ให้เริ่มทำการทดสอบใหม่

ข้อพิจารณาในการเลือกใช้ชุดทดสอบแบบสำเร็จรูป

วิธีทดสอบ	การนำไปใช้	ข้อดี	ข้อเสีย
MSAT	วินิจฉัยโรค	ง่าย สดวกรวดเร็ว	อาจเกิดปฏิกริยาไม่จำเพาะได้
MAT	วินิจฉัยโรค/วิจัย	ความจำเพาะสูง/ สามารถแยกชนิดแอนติเจนได้	ความไวต่ำ / วิธีการยุ่งยาก ซับซ้อน
IHA/LA	วินิจฉัยโรค	ง่าย สดวก รวดเร็ว	ความไว และความจำเพาะ ปานกลาง
IgM ELISA	วินิจฉัยโรค/วิจัย	ความไวและความจำเพาะ สูง ตรวจได้คราวละมากๆ ไม่สดวก ในการตรวจทีละน้อยๆราย	ต้องอาศัยเครื่องมือพิเศษเสริม เช่น Microplate reader / washer
CICA Dipstick	วินิจฉัยโรค	ง่าย สดวก รวดเร็ว มีความจำเพาะสูง	ไม่เหมาะกับการตรวจ คราวละมากๆ / ราคาต่อการ ทดสอบสูง

เครือข่ายการตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซีส ในประเทศ
- สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุข กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข นนทบุรี 11000
โทรศัพท์ 589-9850 - 8
- สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรืการแพทย์ทหาร กรมแพทย์ทหารบก ถนนราชวิถี กรุงเทพ 10400
โทรศัพท์ 245-0456 / 644-4888 ต่อ 4002
- ศุนย์วิจัยโรคเลปโตสไปโรซีส โรงพยาบาลเวชศาสตร์เขตร้อน ถนนราชวิถี กรุงเทพ 10400
โทรศัพท์ 245-8251
- ศูนย์วิทยาศาสตร์การแพทย์ ทั้ง 12 เขตทั่วประเทศ

BECOME A MEMBER
สมัคร ! สมาชิกชมรมรักสุขภาพ
ฟรี ข่าวสาระความรู้เรื่องสุขภาพ

We subscribe to the
HONcode principle
of the Health on the
Net Foundation

ฉ 1999-2000 Thailabonline.com. All rights reserved.
By using this information service, you accept the terms of our Visitor Agreement. Please read it.
The material on Thailabonline.com and iHealthsite.net are for informational purposes only and is not
a substitute for medical advice or treatment for any medical conditions. You should promptly seek
professional medical care if you have any concern about your health, and you should always consult
your physician before starting a fitness regimen.
”Thailabonline.com” and “ihealthsite.net” are trademarks of Crystal Diagnostics Co.,Ltd.