Staining

Browser คุณไม่ support Java / your browser does not support JAVA จึงไม่สามารถแสดงผลได้	Wright-Giemsa Stain สำหรับย้อมดูเม็ดเลือด แดง/ขาว เกล็ดเลือด / เชื้อมาลาเรีย
	CBC Q-dip Stain สำหรับย้อมดูลักษณะเม็ดเลือด แดง/ขาว เกล็ดเลือด
	Gram's Stain สำหรับย้อมดูลักษณะแยกเชื้อแบคทีเรีย จากสิ่งส่งตรวจ
	Modify Kinyoun AFB Stain สำหรับย้อมเพื่อตรวจหาเชื้อวัณโรค (TB) จากสิ่งตรวจ

เป็นสีที่ใช้สำหรับย้อมดูเม็ดเลือดแดง เม็ดเลือดขาว และย้อม
ดูเชื้อมาลาเรีย        ประกอบด้วยสีสำคัญ 2 ตัวใหญ่ๆได้แก่ สี
Wright stain และสี Giemsa stain  ส่วนของเม็ดเลือดที่มี
สภาพเป็นกรดเมื่อย้อมด้วย wright-geimsa stain จะถูกจับ
ด้วยส่วนที่เป็นด่างของสี ( basic dyes )ทำให้ส่วนนั้นติดสี
น้ำเงินหรือม่วง เช่นส่วนนิวเครียสของเม็ดเลือดขาว เป็นต้น
ส่วนของเม็ดเลือดที่มีสภาพเป็นด่าง เมื่อทำการย้อมแล้วจะจับกับ
ส่วนที่เป็นกรดของสี (acid dyes) ทำให้ส่วนนั้นๆติดสีแดง ชมพู เช่น granule ของเม็ดเลือดขาวชนิด
eosinophile เป็นต้นส่วนของสี giemsa stain จะช่วยเสริมการติดสีของเม็ดเลือดแล้วยังช่วยย้อมเชื้อ
มาลาเรียให้เห็นชัดเจนมากขึ้น

ส่วนประกอบของชุดสีย้อม
- สี Wright-Giemsa stain ประกอบด้วย 0.3% Wright stain และ 0.1% Giemsa stain
3% glycerine / 97% Methanol
- Phosphate buffer
- Fixative reagent

วิธีการย้อมสี
1. นำเลือดที่ต้องการย้อมมาทำเป็นแผ่นฟิลม์บางๆบนแผ่นกระจกใส ทิ้งไว้ให้แห้ง
2. นำแผ่นเลือดมาจุ่มลงใน Fixative reagent เพื่อคงรูปร่างของเม็ดเลือดก่อนย้อม ส่วนของ
reagent นั้นหลังการใช้งานต้องรีบปิดฝาเพื่อป้องกันความชื้นในอากาศทำให้น้ำยา
     เสื่อมซึ่งจะมีผลทำให้เม็ดเลือดแดงเปลี่ยนรูปร่างได้
3. นำแผ่นเลือดไปจุ่มลงในสี Wright-Geimsa stain จับเวลานาน 1 นาที
4. นำแผ่นเลือดขึ้น แล้วนำไปจุ่มลงในขวด Phosphate buffer จับเวลานาน 1 นาที
5. ยกแผ่นเลือดขึ้น ล้างสีทีตกค้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำประปา เช็ดทำความสะอาดด้านหลังแผ่น

6. เป่าลมหรือผึ่งลมให้แห้ง นำไปส่องตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

เป็นสีที่ใช้สำหรับย้อมดูเม็ดเลือดแดง เม็ดเลือดขาว และย้อมเชื้อ
มาลาเรีย แบบเร่งด่วน
ประกอบด้วยสีสำคัญ 2 ตัวใหญ่ๆได้แก่ สี Methylene blue
และสี Safanine
ส่วนของเม็ดเลือดที่มีสภาพเป็นกรดเมื่อย้อมด้วย Q-dip stain
จะถูกจับด้วยส่วนที่เป็นด่างของสี ( basic dyes )ทำให้ส่วนนั้น
ติดสีน้ำเงินหรือม่วง เช่นส่วนนิวเครียสของเม็ดเลือดขาว เป็นต้น
ส่วนของเม็ดเลือดที่มีสภาพเป็นด่าง เมื่อทำการย้อมแล้วจะจับกับส่วนที่เป็นกรดของสี (acid dyes)
ทำให้ส่วนนั้นๆติดสีแดง ชมพู เช่น granule ของเม็ดเลือดขาวชนิด eosinophile เป็นต้น

ส่วนประกอบของชุดสีย้อม
- สี Methylene blue buffer
- สี Safranine buffer
- Fixative reagent

วิธีการย้อมสี
1. นำเลือดที่ต้องการย้อมมาทำเป็นแผ่นฟิลม์บางๆบนแผ่นกระจกใส ทิ้งไว้ให้แห้ง
2. นำแผ่นเลือดมาจุ่มลงใน Fixative reagent เพื่อคงรูปร่างของเม็ดเลือดก่อนย้อม ส่วนของ
    fixative reagent นั้นหลังการใช้งานต้องรีบปิดฝาเพื่อป้องกันความชื้นในอากาศทำให้น้ำยา
   เสื่อม ซึ่งจะมีผลทำให้เม็ดเลือดแดงเปลี่ยนรูปร่างได้
3. นำแผ่นเลือดไปจุ่มลงในสี Methylene blue buffer ประมาณ 10-15 ครั้ง
4. นำแผ่นเลือดขึ้น แล้วนำไปจุ่มลงใน Safranine buffer ประมาณ 10-15 ครั้ง
5. ยกแผ่นเลือดขึ้น ล้างสีทีตกค้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำประปา เช็ดทำความสะอาดด้านหลัง
    แผ่นกระจก
6. เป่าลมหรือผึ่งลมให้แห้ง นำไปส่องตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

สี crystal violet จะซึมผ่านผนังเซลของแบคทีเรียเข้าไปใน
cytoplasm ของแบคทีเรีย เมื่อทำการย้อมทับด้วย gram iodine
จะไปจับกับส่วนของ crystal violet เกิดเป็นสารประกอบเชิงซ้อน
เรียกว่า crystal-iodine complex ซึ่งมีขนาดโมเลกุลที่ใหญ่ขึ้น
ในแบคทีเรียชนิดแกรมบวก จะมีไขมันที่ผนังเซลน้อยกว่า
แบคทีเรียชนิดแกรมลบ เมื่อล้างด้วย Acetone-alcohol ซึ่ง
เป็นสารละลายไขมัน จะยังคงสามารถรักษาสารประกอบเชิงซ้อน
ได้อยู่ในแบคทีเรียชนิดแกรมลบ จะมีไขมันที่ผนังเซลมากกว่าแบบแกรมบวก เมื่อล้างด้วย Acetone-alcohol
จะทำให้ผนังเซลแบคทีเรียเกิดช่องว่างขนาดใหญ่กว่า ทำให้สารประกอบเชิงซ้อนหลุดออกจากเซลของ
แบคทีเรียได้ เมื่อทำการย้อมทับด้วยสี safranine จึงทำให้แบคทีเรียแกรมลบติด สีแดง ของ safranine
ส่วนแบคทีเรียแกรมบวกซึ่งติดสี ม่วงน้ำเงิน ของ Crystal violet อยู่แล้วจึงไม่ติดสีแดงของ safranine

ส่วนประกอบของชุดสีย้อม
- สี Crystal violet
- Gram Iodine
- Acetone-alcohol Decolorizer
- สี Safranine

laboratory staining technique that distinguishes between two groups of bacteria by the
dentification of differences in the structure of their cell walls. The Gram stain, named
after its developer, Danish bacteriologist Christian Gram, has become an important tool
in bacterial taxonomy, distinguishing between so-called gram-positive bacteria, which
remain colored after the staining procedure, and gram-negative bacteria, which do not
retain dye. In the staining technique, cells on a microscope slide are heat-fixed (killed)
and stained with a basic dye, crystal violet, which stains all bacterial cells blue; then
they are treated with an iodine-potassium iodide solution that allows the iodine to enter
the cells and form a water-insoluble complex with the crystal violet dye. The cells are
treated with alcohol or acetone solvent in which the iodine-crystal violet complex is
soluble. Following solvent treatment, only gram-positive cells remain stained, possibly
because of their thick cell wall, which is not permeable to solvent. After the staining
procedure, cells are treated with a counterstain, i.e., a red acidic dye such as safranin
or acid fuchsin, in order to make gram-negative (decolorized) cells visible. Counterstained
gram-negative cells appear red, and gram-positive cells remain blue. Although the
cell walls of gram-negative and gram-positive bacteria are similar in chemical composition,
the cell wall of gram-negative bacteria is a thin layer sandwiched between an outer
lipid-containing cell envelope and the inner cell membrane, whereas the gram-positive
cell wall is much thicker, lacks the cell envelope, and contains additional substances,
such as teichoic acids, polymers composed of glycerol or ribitol. The difference in
reactivity between gram-positive and gram-negative bacteria is linked with differences
in physiological properties of the two groups. Gram-positive bacteria are generally more
sensitive to growth inhibition by dyes, halogens, many antibiotics , and to attack by
phagocytosis (see endocytosis ), and are more resistant to digestion by the enzymes
pepsin and trypsin and enzymes in animal sera.

GRAM STAIN TECHNIQUE

Overview

The Gram stain procedure was originally developed by the Danish physician Hans Christian Gram
to differentiate pneumococci from Klebsiella pneumonia. In brief, the procedure involves the application of
a solution of iodine (potassium iodide) to cells previously stained with crystal violet or gentian violet. This
procedure produces "purple colored iodine-dye complexes" in the cytoplasm of bacteria. The cells that
are previously stained with crystal violet and iodine are next treated with a decolonizing agent such as 95%
ethanol or a mixture of acetone and alcohol. The difference between Gram-positive and Gram-negative
bacteria is in the permeability of the cell wall to these "purple colored iodine-dye complexes" when treated
with the decolorizing solvent. While Gram-positive bacteria retain purple iodine-dye complexes after the
treatment with the decolorizing agent, Gram-negative bacteria do not retain complexes when decolorized.
To visualize decolorized Gram-negative bacteria, a red counterstain such as safranin is used after
decolorization treatment

Appearance of the Gram positive coccus and Gram negative bacillus at different stages of the gram staining procedure are illustrated below:

Preparation of the smear

The first consideration is the correct preparation of the smear. Make a thin film of the material on a clean
glass slide, using a sterile loop or swab for viscous specimens. Air dry, then heat fix the slide by passing it
several times through a flame (the slide should not become too hot to touch). Failure to follow these directions may cause staining artifacts and disrupt the normal morphology of bacteria and cells.

To be visible on a slide, organisms that stain by the Gram method must be present in concentrations of a
minimum of 10⁴ to 10⁵ organisms/ml of unconcentrated staining fluid. At lower concentrations, the Gram stain
of a clinical specimen seldom reveals organisms even if the culture is positive. Smears that are not properly fixed tend to be washed away during staining and washing resulting in the absence of stained bacteria.

When cerebrospinal fluid contains only a few organisms, they are more likely to be found if a concentrated
"thick smear" is examined. To prepare a "thick smear" the specimen is spun at high speed and a large drop
of sediment (or multiple drops, drying in between each drop) is placed in the center of the slide and allowed
to air dry. The cytocentrifuge may prove to be useful in concentrating bacteria as well as in preserving cell morphology.

When fluid specimens such as urine or CSF seem to vanish after the staining procedure, a wax mark, placed
near the smeared area on the slide (same side) after the staining procedure (to avoid introducing wax artifacts)
will reduce frustration in locating the specimen under the microscope. The wax mark can be used for quick
focusing.

In a grossly bloody specimen, it may prove difficult to distinguish microorganisms from artifacts. After air-drying
and heat-fixing this type of specimen, the added preparatory step of covering it with distilled water, waiting five minutes, and then rinsing, may cause the red blood cells to lyse and float off.

Staining procedure

Results

As shown below, organisms that retain the violet-iodine complexes after washing in ethanol stain purple and are termed Gram-positive, those that lose this complex stain red from the safranin counterstain are termed Gram-negative.

เชื้อวัณโรค (Mycobacterium tuberculosis) สาเหตุของโรค
วัณโรค ซึ่งเริ่มกลับมาระบาดมากขึ้นโดยเฉพาะในกลุ่มผู้ติดเชื้อ
HIV ตัวเชื้อวัณโรคมีคุณสมบัติพิเศษเฉพาะตัวก็คือ เป็นเชื้อที่
ทนต่อสภาพกรดได้ดีจึงมีเชื้อเรียกอีกอย่างว่า acid fast bacilli
เนื่องจากที่ผนังเซลของเชื้อแบคทีเรียประกอบด้วยกรดไขมันสูง
ถึงร้อยละ 60 ของน้ำหนัก ทำให้การย้อมติดสียาก แต่เมื่อย้อม
ติดสีแล้วกอรปกับคุณสมบัติที่ทนต่อกรด ดังนั้นเมื่อทำการล้างสี
ออกด้วย acid alcohol สีที่ติดกับแบคที่เรียชนิดอื่นๆจะถูกล้างออกได้โดยง่าย ยกเว้นสีที่ย้อมติดบน
เชื้อวัณโรค (TB) จะล้างออกยาก โดยจะเห็นเป็น สีแดง และเมื่อย้อมทับด้วยสีน้ำเงินเพื่อให้เป็นสีพื้น
เพื่อตัดกับสีแดงของเชื้อวัณโรค จะช่วยให้สังเกตุเห็นง่ายมากขึ้น

ส่วนประกอบชุดน้ำยา
1. Kinyoun carbol fuchsin
2. Acid fast alcohol Decolorizer
3. Methylene blue

วิธีการย้อม
1. นำสิ่งส่งตรวจที่ต้องการย้อมเพื่อหาเชื้อวัณโรค ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็น เสมหะ มาเกลี่ยเป็น
แผ่นบางๆบนกระจกย้อมเชื้อ (slide) ตั้งทิ้งไว้ให้แห้งในที่มิดชิด เพื่อป้องกันการฟุ้งกระจาย
ของเชื้อถ้ามีนำแผ่นกระจกไปลนผ่านไฟประมาณ 2-3 ครั้ง เพื่อช่วยให้แห้งและติดแผ่น
กระจกดีขึ้น
2. ย้อมด้วยสี Kinyoun carbol fuchsin นานประมาณ 5 นาที ล้างน้ำ
3. ล้างสีส่วนเกินออกด้วย Acid fast alcohol จนแผ่นย้อมมีสีติดน้อบลง
4. นำไปย้อมทับต่อด้วยสี Methylene blue นาน 5 นาที ล้างสีส่วน้กินออกด้วยน้ำประปา
5. เช็ดแผ่นกระจกให้สะอาด ผึ่งลมให้แห้ง นำไปส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศ์

ThaiL@bOnline - Crystal Diagnostics
Email : info@thailabonline.com
Phone : (02) 803-7310-11 Fax : (02) 803-6705 ext 0